Meteor & Meteor 2.0 光电关联CryoFIB集成荧光显微镜

前言

冷冻电子断层扫描(cryo-ET)是一种非常强大的技术，可以在接近天然状态下以高分辨率研究细胞景像。近年来，该技术越来越受欢迎，越来越多的研究小组正在他们的实验室中实施它。冷冻电子断层扫描的强大功能是毋庸置疑的，但该工作流程非常容易出错，这限制了数据产出。在工作流程中，有两个主要挑战：保持样品无冰污染和目标感兴趣区域(ROI)。荷兰Delmic开发了两种名为CERES和METEOR的工作流程解决方案，以简化整个冷冻电子断层扫描制备工作流程。CERES Ice Defence System由多种创新工具组成，这些工具专为最大限度地减少样品处理(Clean Station)、转移(Vitri-Lock)和CryoFIB研磨冷冻薄片(Ice Shield)过程中的冰晶污染而量身定制。METEOR是一种集成的荧光光学显微镜(FLM)，可大大提高冷冻 FIB/SEM制备薄片的良率，同时减少所需的处理步骤数。实验表明，结合这些创新工具可以提高冷冻电子断层扫描数据质量和通量。METEOR 2.0是METEOR升级版。

METEOR系统介绍

METEOR是一款获奖的荧光显微镜（FLM），可以直接集成到特定的冷冻聚焦离子束（FIB）/扫描电镜（SEM）腔室中。METEOR支持原位冷冻光电联用（cryo-CLEM），并能轻松适应您的工作流程。它不仅减少了显微镜之间的转移步骤，保护脆弱的样品免受不必要的污染，还允许您在铣削过程中和之后成像感兴趣区域（ROI）。通过减少当前繁琐的工作流程中的转移步骤，METEOR可以大大降低冷冻关联显微技术工作流程的复杂性。您的样品薄切片制备工作流程将简化到7个制造步骤：加载样品，然后捕获荧光显微图像和扫描电镜图像，且无需进行样品转移，在系统将两个图像自动关联后，直接移至目标区域，在完成薄切片研磨之后，用荧光显微镜确认感兴趣区域是否完好。

对于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程，这使得验证感兴趣区域（ROI）是否包含在样品中成为可能。不仅来自样品的荧光标记（FLM）信号确认了目标蛋白质正在通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）被解析，它还使宝贵的透射电镜（TEM）机时能更好地用于有用的样品。在“铣削和观察”工作流程中，随着更多材料被铣削，可在原位获取荧光标记（FLM）数据，从而在整个生物材料体积中提高功能和结构数据的相关性。

冷冻cryo-ET和体积冷冻CLEM在细胞生物学、病毒学、微生物学、免疫学和药物开发领域都能揭示新的见解。通过冷冻电镜获得的深刻见解有助于在接近天然的细胞环境中以亚纳米分辨率揭示生物结构。不仅无需蛋白质纯化，该技术还允许观察蛋白质-蛋白质和蛋白质-药物相互作用。因此，冷冻电镜有可能提供更有效和针对性的药物设计流程，并加速药物开发进程。借助体积CLEM，可获取整个细胞的功能和结构信息，提供更全面的视角。细胞器形态的变化及其分布可轻松追溯到蛋白质表达的水平和位置。

很不幸，通过冷冻cryo-ET和体积cryo-CLEM获取有用见解的速度受到了其复杂流程的阻碍。当前工作流程包括先用独立的冷冻荧光显微镜cryo-FLM对样品进行成像，再将其转移到cryo-FIB设备中，这一过程可能会非常繁琐和令人沮丧。样品转移过程中可能造成的样品损坏和污染，以及在材料被铣削去除时难以检查样品，这些都对成功获取良好数据造成了严重影响。这些挑战以及冷冻cryo-ET和体积冷冻关联显微镜CLEM的巨大潜力，激励我们开发解决方案，以简化流程并让研究者充分发挥潜力。

使用METEOR引导薄片制备时，用户首先将样品装载至配备METEOR的cryo-FIB中。随后将电镜载物台移至METEOR位置，获取全景图像和高精度Z轴堆栈，从而定位目标区域(ROI)。接着移动载物台至SEM位置采集同一ROI的SEM图像。通过图像关联分析，用户可确定薄片制备位置并启动铣削。在铣削过程中及完成后，均可根据荧光信号验证薄片中的ROI存在性，之后再将样品转移至冷冻透射电镜(cryo-TEM)。薄片的荧光显微镜(FLM)信号不仅能确认目标蛋白质正被冷冻电子断层扫描(cryo-ET)解析，还可确保宝贵的透射电镜(TEM)机时仅用于有用的样品。

在三维冷冻光电联用成像中，样品首先通过METEOR进行成像以确定目标区域(ROI)。随后使用扫描电镜(SEM)获取ROI的高对比度图像，接着用聚焦离子束(FIB)刻蚀样品表层，之后再次使用SEM对刚暴露的表面进行成像。这种"铣削-观察"工作流程将在整个样品体积内重复进行。借助METEOR，随着更多材料被铣削去除，可以持续监测ROI的荧光信号，从而在整个生物材料体积内实现功能与结构数据的关联性优化。

METEOR系统由3个主要部分组成：电子机架（放置在显微镜房间内）、主体（安装在FIB/SEM聚焦离子束双束电镜的一个端口上）和电镜腔室内光学器件（安装在FIB/SEM腔室内）。METEOR系统配有一台控制PC及一套ODEMIS采集软件，用于系统控制及荧光图像的采集。

Delmic冷冻解决方案还包括：

CERES Clean Station 清洁的制备工作站: 在定制的高效清洁站中制备低温EM样品，以完全防止冰污染；每一步都在无水手套箱（湿度<1%/1ppm水）中轻松制备低温EM样品。

CERES Ice Shield 冰盾：在冷冻薄片制备过程中提供终极保护，防止冰污染；采用专有技术，在薄片研磨过程中保护您的低温样品免受寄生冰的生长；使冷冻FIB制备更多无冰污染的薄片，以获得高质量的断层图像和高通量。

CERES Vitri-Lock 高真空低温传输模块：可实现安全无冰污染的低温样品转移；在CERES制备工作站和CryoFIB之间在高真空下传输低温样品，以尽量减少转移过程中水分的存在；采用主动冷却方式，样品可以保持玻璃化状态长达30分钟。

METEOR 2.0 系统介绍

METEOR 2.0是新一代冷冻荧光显微镜系统，专为无缝集成至冷冻聚焦离子束 (cryo-FIB) 而设计。该系统可在高真空腔体内直接进行荧光成像，省去不必要的样品转移步骤，从而降低冰污染、样品失玻璃化以及其他损伤的风险。METEOR 2.0为用户提供简化且可靠的工作流程，满足不断发展的冷冻电子断层扫描 (cryo-ET) 研究需求，确保薄片制备过程高效、精准且无污染。

METEOR 2.0结合大视野成像能力，通过图像拼接及自动对焦算法，可实现对样品潜在铣削区域的快速筛查。高速滤光轮支持快速多通道成像，单次筛查即可获取样品中的所有荧光信号的全部分布信息。

METEOR 2.0配备高倍、高数值孔径物镜，确保生物结构的高分辨率精细成像。 系统拥有大视野成像能力，可在保持亚细胞级分辨率的同时观测完整的生物体。单波段滤光片有效减少光谱串扰，确保标记结构的精准呈现。

METEOR 2.0通过高数值孔径(NA)物镜的高光子收集能力与优化光路设计的结合，确保最大量光子到达相机。此外，相机的高量子效率使这些光子能充分参与成像。 因此，即便最终薄片中最微弱的残留荧光信号，也能通过最小激发功率被检测到，从而有效避免薄片损伤或玻璃化状态破坏。

METEOR 2.0可在高真空冷冻 FIB/SEM腔室内，实现FIB铣削后薄片的即时荧光验证。此功能避免了额外转移导致的污染，确保样品保持原始状态，同时提升冷冻电子断层扫描 (cryo-ET) 的通量效率。

METEOR 2.0搭载ODEMIS软件，界面友好、直观易用且开源，旨在优化荧光成像流程，提升操作效率与用户体验。ODEMIS软件特点：一键切换FIB、SEM和FM成像模式；调整、保存并重复调用成像参数；通过冷冻载物台导航FM模式；通过自动对焦，捕获并拼接大范围图像；针对栅网缺陷调整自动对焦；实现 SEM 与FM图像相关联导航；保存ROI的XYZ坐标及聚焦位置；支持以 3D TIFF 文件格式采集 z-stack 图像；与第三方软件无缝集成 (MAPS、AutoTEM、ImageJ 等)；免费授权与更新。
使用ODEMIS Viewer可直观浏览和检查图像： 
o Z轴堆栈最大强度投影 
o 直方图调整 
o 元数据查看 
o 导出带比例尺的PNG图像，用于演示或发表

ODEMIS Advanced是用于精准自动化关联冷冻薄片制备的一体化软件。ODEMIS advanced是一款开源软件，涵盖自动化关联冷冻薄片制备所需全部功能。集多模态成像能力与2D/3D关联功能，Odemis Advanced作为一站式平台，简化相关冷冻薄片制备流程，免去使用多款软件的繁琐。 它在标准版ODEMIS功能基础上扩展，提供以下高级功能：FIB与SEM成像；简化FIB/SEM重合点的标定；3D FIB与荧光显微镜 (FM)关联，实现ROI精确定位；自动化多位点薄片铣削，支持高通量制备；在薄片区域实现自动荧光检测，减少用户操作干预。
METEOR 2.0系统定制：METEOR 2.0在物镜、相机、激发波长和发射滤光片组上具有高度可定制性，可根据具体的科研问题灵活配置系统，实现最优成像效果。系统配置可根据不断变化的研究需求轻松调整和升级。我们提供向后兼容的更新方案，确保设备始终保持最新状态。